DNA microarray 실험 데이터의 표준화 작업

<목 차>

1. 서론

2. 본론

(1) Microarray 방법의 절차

(2) Microarray 방법으로 생성되는 데이터 형태

(3) Microarray 데이터의 표준화 작업

3. 결론

4. 참고문헌

1. 서론

생물체는 수천 개의 유전자와 그들의 산물(RNA와 단백질)이 복잡하고 조화로운 방식에 의해 기능을 함으로써 생명을 유지하고 있다. 기존의 전통적인 분자생물학에 의한 연구방법은 단일 유전자에 대한 실험에 근거하여 진행되기 때문에 그 결과물 또한 매우 제한적이고 유전자의 전체 움직임을 관찰하기에는 한계가 있었다. 그러나 분자생물학적인 실험기술(High-throughput technology)과 robotics 기술의 발달로 인해 등장하게 된 DNA microarray(또는 microchip)란 새로운 개념의 기술이 도입되어 이제는 마이크로 단위로 실험조작의 한계가 줄어들면서 생물 연구자들은 이러한 한계를 극복해 나가고 있다. 이러한 microarray 기술을 통하여 하나의 칩(chip)상에서 전체 유전체(genome)의 발현양상을 탐색할 수 있게 되었고, 동시에 수천 개의 유전자들 간의 상호작용도 관찰이 가능하게 되었다. microarray 기술은 짧은 시간에 엄청난 양의 데이터를 생성할 수 있는 가능성을 지니고 있어 생명과학 분야의 새로운 연구 도구로 각광을 받고 있다. 이처럼 이전까지는 예측 불가능한 문제에 DNA microarray방법을 이용하여 유전자 발현과 유전자의 프로파일을 연구함으로써 복잡계인 생물체를 이해하는 데 새로운 방향으로의 접근이 가능하게 됨에 따라 microarray data에 대한 공유의 필요성이 대두되었다. 이것은 각 실험실의 microarray 실험으로 질병이나 각 생명현상에 관련된 여러 흥미로운 유전자가 발견되었다 하더라도 한 실험실에 분석하고 연구할 수 있는 유전자는 불과 몇몇 종류의 유전자에 불과하기 때문에 연구하지 못하거나 분석 시 발견되지 못하는 유전자들은 유기 방치되어 버리는 경우가 대부분이다. 이러한 분석의 문제점은 microarray data의 공유를 통해 동일한 현상이나 작용을 연구하는 각 실험그룹의 data를 비교결합해서 analytic flexibility를 높일 수 있고, 서로 다른 array platform이나 methodology를 비교 분석하여 방법을 개선시킬 수 있다. 따라서 각 실험실에서 얻어진 microarray data를 상호간에 공유하기 위해서는 실험방법과 실험data를 위한 표준화가 절실히 요구된다. 현재 각 연구그룹들은 microarray data를 자신의 web site나 GEO와 ArrayExpress 등에 공개하고 있다. 그러나 각 실험실에서 얻어진 microarray data의 공개방식조차도 표준화 작업이 이루어져 있지 않아 실험data에 대한 신뢰성이 낮을 뿐만 아니라 공개되고 있는 data의 양도 매우 적은 편이다. GenBank 데이터베이스와 같이 public 데이터베이스에 보고 되는 DNA나 protein 서열data의 경우에는 각 데이터베이스의 일정한 format으로 입력, 저장되고 있으므로 각 연구그룹들이 data를 상호 공유를 할 수 있는 반면, microarray에 관련된 실험을 하는 연구자들은 모두 다양한 형태의 microarray 기술과 분석도구들을 사용하기 때문에 다른 연구자들이 그 데이터를 서로 공유하고 이용하는데 한계가 있다. 다시 말해서 한 연구실에서 얻은 데이터를 다른 연구실에서 실험한 데이터와 비교할 수 있는 표준 및 결과를 발표할 논문에서 microarray 실험을 어떻게 묘사할 것인지에 대한 규칙, microarray에 대한 database의 schema나 저장 내용에 대한 표준도 마련되어 있지 않은 실정이다. 이러한 한계를 극복하고자 일부 연구그룹에서는 microarray 데이터를 묘사하고 공유할 수 있도록 하는 표준화 작업인 MIAME에 기초를 둔 check-list를 제안하고 있다. 본 리뷰에서는 microarray 실험방법의 절차와 이로부터 생성되는 데이터의 형태를 살펴보고, 이러한 데이터의 표준화 작업에 대해 살펴보고자 한다.

2. 본론

(1) Microarray 방법의 절차

DNA microarray 실험단계는 크게 5단계로 이루어진다(그림 1).

<그림 1. cDNA microarray 실험과정 (Ref. Nature Genetics, 29(4), 365-371 (2001))>

- 1단계 : DNA 칩을 제작하는 단계로 cDNA microarray인 경우 spotting할 DNA clone들을 PCR에 의해 증폭하고 정제한 후, 슬라이드 위에 robot을 이용하여 찍어서 칩을 제작한다. 그리고 oligonucleotide 칩인 경우에는 슬라이드 칩 위에 디자인된 oligonucleotide를 각각 합성하면서 칩을 제작한다.

- 2단계 : 시료준비 단계로 실험하고자 하는 test 시료와 reference 시료에서 total RNA를 각각 분리한 후, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)방법을 통하여 역전사시키는 과정에서 두 가지 형광색소인 빨간색(Cy5)이나 녹색(Cy3)로 각각 표지하여 시료의 cDNA를 합성하는 단계이다. 그러나 시료로부터 RNA를 추출하는 방법은 비교적 간단하지만 DNA 칩의 탐식자(probe)로 사용되는 cDNA 제조에 필요한 현재의 형광물질 표지방법은 비교적 많은 양의 RNA를 요구하기 때문에 시료의 양이 적을 경우 이를 이용하기 어려운 점이 있다. 이를 극복하기 위해 PCR을 이용한 total cDNA의 증폭, 또는 방사선 동위원소를 이용한 표지법의 개발 등의 방법이 제시되고 있다.

- 3단계 : hybridization 과정으로 합성한 두 개의 시료 cDNA를 같은 양으로 섞어서 제작해놓은 하나의 microarray 칩에 결합시키고, 결합이 안 된 cDNA들을 씻어낸다.

- 4단계 : 스캐닝 과정으로 레이져 형광 스캐너를 이용하여 각 spot의 형광정도를 읽어 들인다. 각각 유전자의 형광 정도는 그 유전자의 발현정도를 알려주는 것으로 이들 정보는 microarray 분석 프로그램에 의하여 분석되어 진다.

- 5단계 : 각 유전자의 발현 수치의 데이터를 이용하여 분석하는 단계이다. 한 번의 실험으로 수 천 가지 data를 분석해야 하는 상황이 발생하고, 각 칩마다 실험의 재현성이 낮으므로 반복실험을 하게 된다. 따라서 이들 칩으로부터 생성되는 데이터를 효과적으로 분석하고 그 결과를 공유하고 저장하는 것이 중요한 요소가 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 데이터 포맷의 개발과 표준을 만드는 시도가 다양하게 이루어지고 있으며, 그 결과들이 많은 데이터베이스들과 연계되어 체계화되어 가고 있다.

(2) Microarray 방법으로 생성되는 데이터 형태

유전자 발현 데이터는 세 가지 부분으로 나눌 수 있다 (그림 2). 첫 번째 부분은 gene annotation부분으로 이것은 유전자 서열관련 데이터베이스에 연결되어 있는 부분이며, 두 번째 부분은 sample annotation부분으로 실험에 사용된 시료의 정보를 외부 데이터베이스와 연결하는 부분이다. 그리고 세 번째 부분은 gene expression matrix로 이것은 matrix 형태를 취하고 있으며 각 위치의 정보는 개별적인 유전자의 특징적인 발현정보를 담고 있다.

이러한 gene expression matrix는 microarray 데이터로부터 만들어질 수 있는데 크게 나누어 세 가지 과정을 거쳐서 생성되게 된다.

처음에 스캐닝 후에 생성된 각 raw image 데이터로부터 각각 quantification matrix를 생성한다. 이것은 각 image의 수치화된 값들과 spot의 위치정보로 구성된 매트릭스 형태의 데이터이다. 그 후 각 image의 quantification matrix로부터 이후의 분석 작업을 하게 되는 유전자 발현 데이터 matrix가 생성되게 되는 것이다.

<그림 2. microarray 유전자 발현 데이터의 세 가지 프로세싱 단계 >

(3) Microarray 데이터의 표준화 작업

Microarray 데이터의 표준화 작업에는 크게 두 가지로 구분할 수 있다.

첫 번째는 데이터의 표준규정을 제안하는 것이고, 두 번째는 컴퓨터데이터의 포맷을 개발하는 것이다.

데이터의 표준규정의 제안은 Minimal Information About a Microarray Experiment (MIAME)로 불리는 모임에서 microarray 데이터 분석과 응용을 위해서 microarray 실험에서 수록되어야 할 데이터의 종류와 그 데이터를 공유하도록 해줄 수 있는 표준 포맷, 즉 데이터를 수집할 때의 시료와 실험 조건들에 대한 규정의 초안을 제안하였고, 이 모임을 주도한 유럽 생물 정보학 연구소(European Bioinformatics Institute)의 Alvis Brazma을 대표로 하여 작년 12월 달에 Nature Genetics 저널에 "Minimum information about a microarray expriment (MIAME)-toward standards for microarray data"라는 제목으로 출판하였다.

MIAME는 실험결과를 보증하고 검증하기 위해서 microarray 실험에 대해 보고하여야 하는 최소한의 필수적인 정보를 담은 서류양식이라고 할 수 있다. 현재 발표된 MIAME version 1.0의 구성을 살펴보면, 총 6개의 부분으로 구성되어 있고, 각 부분의 연결은 다음의 그림 3과 같다.

<그림 3. microarray 실험의 6가지 구성부분 모식도 >

MIAME를 이루는 6부분의 구성을 자세히 살펴보고자 한다.

① Experimental design : microarray 실험의 전반적인 정보

각 실험의 저자명, 연락정보, 연결 가능한 링크정보, 인용, 실험제목, 실험내용, 출판문헌정보

② Array design : 사용하는 array 정보와 array상에서 위치한 spot의 정보

array 정보(platform type, provider, surface type)

사용한 element나 spot정보(합성한 oligonucleotides나 cDNA clones로부터 합성한 PCR 생성물), 각 element의 특징적인 정보(DNA 서열정보, quality-control indicators)

③ Sample : 사용한 시료정보, 시료준비과정과 표지과정에 대한 정보

이 부분은 세 항목으로 이루어지며, qualifier, value, source등의 triplets형식인 리스트로 구성된다. 시료의 생물학적 실험정보, RNA 추출정보, 표지방법의 정보

④ Hybridization : hybridization 실험과정과 parameters 정보

hybridizations 실험단계의 조건, 실험 계획, 실험 parameters (hybridization용액, blocking agent의 종류, 세척과정, 시간, 부피, 온도, 실험기구)

⑤ Measurement : 스캐닝 images정보와 스캐닝 parameters와 실험계획

실제적인 실험결과 정보 : 스캐닝 정보, 스캔 parameters, 실험계획

실험데이터 정보의 3단계 프로세싱 과정 (그림 2)

스캔 image 정보 → image 분석을 위한 microarray quantification matrices

→ 반복실험 데이터들을 합친 후 normalization후의 최종 gene expression matrix

⑥ Controls : normalization 전략과 quality control 형태 그리고 세부사항

마이크로어레이 실험 데이터의 normalization 단계

마이크로어레이 실험 각 단계의 기술적인 변수

예) 사용한 normalization 방법, quality control 알고리즘, array내 element의 성분과 위치     정보

두 번째 과제는 microarray 데이터를 전송하고 보관할 수 있는 컴퓨터 포맷을 마련하는 일이다. 이 문제를 해결하기 위한 제안은 MGED(Microarray Gene Expression Database) 협회에 참여한 OMG 그룹에서 초기에 제안되었으며, 현재 미국 버클리에 있는 캘리포니아 주립대학의 Paul Spellman이 이끄는 그룹에 의해 MIAME 데이터를 실험실간에 전달하기 위한 표준 데이터 교환 포맷인 MAGE-ML(Microarray Gene Expression Markup Language)가 제안되어 있다. 이 MAGE-ML는 XML(eXtensible Markup Language)에 기반을 둔 microarray 데이터용 데이터 포맷이며, 대부분의 생물학적 정보들은 웹형식으로 제공하고 있어서 모든 브라우저에 호환성을 지닌 XML형식으로 저장을 하여 다른 응용 프로그램을 이용한 가공이 용이하도록 한 것이다.

그 외에도 microarray 기술을 개발하는 두 개의 생명공학 회사인 Rosetta Inpharmatics Inc.와 NetGenics Inc.에서도 독립적으로 제안을 발표했다.

3. 결론

DNA microarray의 유용성은 이미 이를 이용한 수많은 논문과 연구결과를 통해 알 수 있었다. 대량의 유전자 발현양상을 비교 관찰함으로써 새로운 유전자의 발굴이나 기능예측, 유전자군의 클러스터링 등 microarray 방법의 활용은 점차적으로 넓어져 가고 있다. 이러한 유전자 발현정보들이 축적되어 복잡한 생명현상의 메카니즘을 이해하고 여러 질병의 진단과 예측, 그리고 치료에 따른 반응을 계속 확인하는 것이 가능해질 것이다. 이러한 확장가능성에도 불구하고 현재의 microarray 실험은 개별적으로 이루어지고 있으며, 서로 공유할 수 없는 데이터 저장 및 관리로 인해 더 많은 정보를 얻을 수 없는 상황이지만, 이러한 한계는 microarray 데이터의 표준화 작업을 통해 충분히 극복되어 질 수 있을 것이다. 먼저 microarray 실험그룹간에 공식적으로 인정된 표준포맷의 채택이 필수적이며, 실험자들에게는 제안된 데이터의 표준규정에 따라 데이터를 입력, 관리하는 것이 요구된다. 이와 함께 입력된 데이터를 이용하여 호환성이 높은 XML 기반의 여러 가지 제안된 포맷을 통해 각 연구그룹간의 데이터를 공유하고 공동의 데이터베이스를 구축함으로써 실험자들은 더 많은 연구결과를 얻게될 것이다. 아울러 이러한 표준화 작업이 결실을 거두기 위해서는 저널 편집자들의 도움이 또한 필요하다. 투고된 논문을 심사하는 과정에서 공식적으로 표준화된 형식의 데이터를 제출하도록 하는 것이 매우 중요할 것이다.

끝으로 microarray 데이터뿐만 아니라 생물정보의 표준화 작업은 다양하게 이루어지고 있으며 이것은 생물정보학의 발전과 함께 보다 정확한 생명현상을 이해하는데 크게 공헌하게 될 것이다.

4. 참고문헌

◦ Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, Sherlock G, Spellman P, Stoeckert C, Aach    J, Ansorge W, Ball CA, Causton HC, Gaasterland T, Glenisson P, Holstege FC,Kim    IF, Markowitz V, Matese JC, Parkinson H, Robinson A, Sarkans U,                   Schulze-Kremer S, Stewart J, Taylor R, Vilo J, Vingron M., Minimum information    about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.,      Nat. Genet., 2001, 29(4), 365-371.

◦ Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM., Expression profiling using      cDNA microarrays, Nat. Genet., 1999, 21(1), 10-14.

◦ Brazma A, Robinson A, Cameron G, Ashburner M., One-stop shop for microarray    data, Nature, 2000, 403(6771), 699-700.

◦ Woong-Yang Park, Application of DNA Chip Technology to Biomedical Research,     대한생화학분자생물학회

◦ GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)

◦ ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress)

◦ MGED (http://www.mged.org)

◦ OMG (http://www.geml.org/omg.htm)

◦ MAGE-ML (http://www.mged.org/Workgroups/MAGE/mage-ml.html)

◦ MIAM ver 1.1 document

(http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame1.1_draft5.doc)